高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography 簡稱 HPLC）是一種用途廣泛、分析能力極強(qiáng)的色譜技術(shù)，在藥物生產(chǎn)和研究的許多方面都有應(yīng)用。它根據(jù)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和成分，將混合物分離或識別為不同的成分。
引言
HPLC 應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)。它非常靈敏、特異和精確。
- 它是柱層析的一種特殊形式，用于生物化學(xué)和分析，以分離、鑒定和量化混合物中的活性化合物。
- 在 HPLC 上有填料（固定相），泵使流動相通過色譜柱，檢測器顯示分析物的保留時間。
- 保留時間是可變的，主要取決于固定相、分析物和所用溶劑之間的相互作用。
- 少量待分析樣品被引入流動相流，并通過與固定相的特定化學(xué)或物理相互作用而被保留
- 保留取決于分析物的性質(zhì)以及固定相和流動相的成分。
- 高效液相色譜法（HPLC）最常用的溶劑是甲醇和乙腈。
原理
高效液相色譜法（HPLC）是將少量液體樣品注入裝有微小顆粒（直徑為 3 至 5 um，稱為固定相）的管子中，樣品中的單個成分隨著通過泵輸送的高壓液體（流動相）通過色譜柱進(jìn)入裝有顆粒的管子。
柱填料用于將成分相互分離。這涉及到其分子與填料顆粒之間的各種化學(xué)和/或物理相互作用。
分離出來的成分會在色譜柱出口處被檢測器檢測到，檢測器會測量這些成分的含量。檢測器的輸出稱為 "液相色譜圖"。
圖 1. 描述了高效液相色譜法的基本原理。步驟 1.引入樣品（流動相）。步驟 2.將樣品分離成各種成分（固定相）。步驟 3.將樣品分離成各組分（流動相）。
與低壓柱液相色譜法相比的優(yōu)勢
與傳統(tǒng)的低壓柱液相色譜法相比，高效液相色譜法（HPLC）有許多優(yōu)勢。
- 靈敏度更高（可使用各種檢測器）
- 更高的分辨率
- 速度更快
- 便于樣品回收（移除的流動相更少）
- 多種固定相可適用
分支
色譜法分為氣相、液相和超臨界流體技術(shù)。氣相色譜法又分為氣-液技術(shù)和氣-固技術(shù)。
液相色譜法分為薄層色譜法等相對較多的技術(shù)。加壓液相色譜法又可分為離子交換色譜法、排阻色譜法、分配色譜法和液固色譜法。
液相色譜法分為薄層色譜法等相對較多的技術(shù)。加壓液相色譜法又可分為離子交換色譜法、排阻色譜法、分配色譜法和液固色譜法。
圖 2.描述色譜法的分支。
類型
HPLC 的以下變體取決于工藝中的相系統(tǒng)（固定相）。
1. 正相高效液相色譜法
又稱正相色譜法或吸收色譜法。這種方法根據(jù)極性分離分析物。它有一個極性固定相和非極性流動相。因此，固定相通常為二氧化硅，典型的流動相為正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。該技術(shù)適用于對水敏感的化合物、幾何異構(gòu)體、順反異構(gòu)體、類別分離和手性化合物。
2. 反相高效液相色譜法
固定相為非極性（疏水性），流動相為水性、中等極性。它的工作原理是疏水相互作用，因此材料的非極性越強(qiáng)，保留時間就越長。這種技術(shù)適用于非極性、極性、可電離和離子分子。
3. 體積排阻高效液相色譜法
又稱凝膠滲透色譜法或凝膠過濾色譜法。色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料，顆粒根據(jù)分子大小被分離。較大的分子迅速通過色譜柱；較小的分子則穿過多孔填料顆粒，隨后洗脫出來。體積法還有助于確定蛋白質(zhì)和氨基酸的三級和四級結(jié)構(gòu)。它還可用于測定多糖的分子量。
4. 離子交換高效液相色譜
在這種色譜法中，保留是基于溶質(zhì)離子與固定相上的帶電位點(diǎn)之間的吸引力。帶相同電荷的離子會被排除在外。這種技術(shù)可用于純化水、蛋白質(zhì)的配體和離子交換色譜、碳水化合物和低聚糖的高 pH 陰離子交換色譜等。
5. 生物親和高效液相色譜
在這類色譜中，分離是基于蛋白質(zhì)與配體的可逆相互作用。
組成
圖片系統(tǒng)的核心是進(jìn)行分離的色譜柱。
1. 溶劑儲液器：玻璃儲液器中含有流動相內(nèi)容物。高效液相色譜法中的流動相或溶劑通常是極性和非極性液體成分的混合物，其各自的濃度根據(jù)樣品的成分而變化。
2. 泵：泵將流動相從溶劑儲液器中吸出，并迫使其通過系統(tǒng)的色譜柱和檢測器。根據(jù)色譜柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流動相的成分等因素，工作壓力最高可達(dá) 42000 kPa（約 6000 psi）。
3. 樣品進(jìn)樣器：進(jìn)樣器可以是單次進(jìn)樣，也可以是自動進(jìn)樣系統(tǒng)。用于高效液相色譜系統(tǒng)的進(jìn)樣器應(yīng)能在高壓（高達(dá) 4000 psi）條件下對體積在 0.1-100 mL 范圍內(nèi)的液體樣品進(jìn)行進(jìn)樣，并具有較高的重現(xiàn)性。
4. 色譜柱：色譜柱通常由拋光不銹鋼制成，長度在 50 至 300 毫米之間，內(nèi)徑在 2 至 5 毫米之間。色譜柱通常填充粒徑為 3-10 微米的固定相。內(nèi)徑小于 2 毫米的色譜柱通常稱為微孔色譜柱。理想情況下，流動相和色譜柱的溫度在分析過程中應(yīng)保持恒定。
5. 檢測器：高效液相色譜檢測器位于色譜柱的末端，在分析物從色譜柱洗脫出來時對其進(jìn)行檢測。常用的檢測器有紫外光譜檢測器、熒光檢測器、質(zhì)譜檢測器和電化學(xué)檢測器。
6. 數(shù)據(jù)收集裝置：檢測器發(fā)出的信號可收集到圖表記錄器或電子積分器上，它們的復(fù)雜程度和處理、存儲和再處理色譜數(shù)據(jù)的能力各不相同。計算機(jī)將檢測器對每種成分的響應(yīng)進(jìn)行整合，并將其放入色譜儀中，以便于讀取和解釋。
應(yīng)用
高效液相色譜法可獲得的信息包括化合物的分辨、鑒定和定量。它還有助于化學(xué)分離和純化。高效液相色譜的其他應(yīng)用包括
- 制藥應(yīng)用：控制藥物穩(wěn)定性。藥物劑型的片劑溶出度研究。藥品質(zhì)量控制
- 環(huán)境應(yīng)用：檢測飲用水中的酚類化合物。污染物的生物監(jiān)測。
- 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：生物樣本中的藥物定量。鑒定血液、尿液等中的類固醇。紡織品染料的法醫(yī)分析。測定血液、尿液等中的可卡因和其他濫用藥物。
- 食品和香料：軟飲料和水的質(zhì)量測定。果汁中的糖分分析 蔬菜中多環(huán)化合物的分析。防腐劑分析。
- 在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用：尿液分析、血液中的抗生素分析。肝臟疾病中膽紅素和膽綠素的分析。檢測腦細(xì)胞外液中的內(nèi)源性神經(jīng)肽等。
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