本次“旅行”咱們繼續(xù)來流式技術(shù)的世界里遨游，今天跟各位旅行家去探訪流式世界的老牌強(qiáng)者——質(zhì)譜流式。之前咱們一起游覽了光譜流式“景區(qū)”，屬于新生力量，質(zhì)譜流式的出現(xiàn)比全光譜流式早幾年，在細(xì)胞多色檢測領(lǐng)域，質(zhì)譜流式是絕對的前輩”高人“。
流式細(xì)胞術(shù)從20世紀(jì)60年代末開始，成為細(xì)胞研究的重量級工具。但因為熒光素光譜重疊問題，能同時研究的標(biāo)記物數(shù)量有限，這大大限制了它在復(fù)雜生物體系研究中的應(yīng)用。就在這個背景下，質(zhì)譜流式應(yīng)“需”而生。在全光譜流式還未出現(xiàn)的日子里，研究人員想要深入了解細(xì)胞的深層秘密，質(zhì)譜流式就是他們唯一的依靠。不過，那時候質(zhì)譜流式的儀器和試劑都價格不菲，可以說是流式界的“貴”族。但現(xiàn)在不一樣了，咱們國產(chǎn)廠商開始在這個領(lǐng)域發(fā)力，質(zhì)譜流式會越來越親民，性價比更高。
咱還是老規(guī)矩。先給各位旅行家瞅瞅今兒這場 “探訪之旅” 的攻略是咋安排的。這第一站呢，咱就去扒一扒質(zhì)譜流式的發(fā)展歷程。接著第二站，就深入探究下到底啥是質(zhì)譜流式，順便把它的工作原理也搞清楚，揭開它神秘的面紗。到了第三站，咱再去市場上逛逛，瞅瞅都有哪些質(zhì)譜流式的產(chǎn)品在 “爭奇斗艷”。Go！馬上開啟今天這場超有趣的探索之旅！
第一站：質(zhì)譜流式的發(fā)展簡史
說起質(zhì)譜流式，就如同文章標(biāo)題里講的那般，恰似質(zhì)譜和流式之間一場美妙又浪漫的邂逅。至于流式的過往，咱和各位旅行家之前可都已經(jīng)詳細(xì)的聊過啦。剛加入咱們旅途的旅行家，可以去瞅瞅流式之眼的開頭三篇與“與大家的聊天記錄”，本篇就不重復(fù)嘮叨了。接下來，就從質(zhì)譜這兒開始講起。為啥從這開始？因為質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)這個厲害的技術(shù)，原本就是在質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上衍生發(fā)展而來的。
1.質(zhì)譜(Mass)技術(shù)的誕生：
這里我們通過兩個在質(zhì)譜領(lǐng)域有著極大貢獻(xiàn)的科學(xué)家來看質(zhì)譜技術(shù)的起源。
第一位叫做阿瑟·杰弗里·登普斯特（ Arthur Jeffrey Dempster），他第一臺現(xiàn)代質(zhì)譜儀的發(fā)明者，于 1918 年建造了世界上第一臺質(zhì)譜儀（圖1-1），能夠分離并精確測量不同帶電粒子的質(zhì)量，對于研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)和同位素分析具有劃時代的意義。
第二位叫弗朗西斯·威廉·阿斯頓（Francis William Aston），他在1919年首次制成了聚焦性能較高的質(zhì)譜儀（圖1-2），并用此來對許多元素的同位素及其豐度進(jìn)行測量，肯定了同位素的普遍存在，還提出了元素質(zhì)量的整數(shù)法則，因此榮獲了 1922 年的諾貝爾化學(xué)獎。
2.質(zhì)譜流式的誕生及商品化：
因為有了前輩們的不懈努力和卓越貢獻(xiàn)，質(zhì)譜技術(shù)才能如同茁壯成長的樹苗，一路蓬勃發(fā)展。時間轉(zhuǎn)瞬即逝，到了 2009 年。在這個時期，傳統(tǒng)的熒光流式技術(shù)其實已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，在很多方面都有了顯著的提升。然而，任何技術(shù)都會面臨其局限性，傳統(tǒng)熒光流式由于技術(shù)條件的限制，始終無法有效地避免熒光素光譜相互重疊，這就導(dǎo)致了當(dāng)時細(xì)胞多參數(shù)檢測最多就只能同時檢測 18 個熒光參數(shù)，很難再繼續(xù)拓展。
為了解決這個問題，多倫多大學(xué)的Tanner 團(tuán)隊另辟蹊徑，他們基于發(fā)展成熟的高靈敏的質(zhì)譜檢測技術(shù)，用穩(wěn)定的金屬同位素標(biāo)記探針替代傳統(tǒng)的熒光分子，結(jié)合敏感且高參數(shù)的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）免疫分析技術(shù)與流式的液流系統(tǒng)，于2009年創(chuàng)造出了全新的單細(xì)胞分析平臺--質(zhì)譜流式系統(tǒng)，命名為CyTOF，成功的避免了熒光素光譜重疊問題, 這一突破使得在單細(xì)胞水平上同時檢測超過 40 個參數(shù)成為可能，開啟了高維單細(xì)胞分析的新時代。
緊接著加拿大DVS Sciences 公司將CyTOF商品化，同年推出世界首款CyTOF質(zhì)譜流式系統(tǒng)：CyTOF 1(圖1-3)，
圖1-3.CyTOF 12013年DVS Sciences 公司又推出升級版的CyTOF2（圖1-4）。
2014 年，美國Fluidigm（富魯達(dá)）公司收購了 DVS Sciences 公司和 CyTOF 技術(shù)。此后，質(zhì)譜流式技術(shù)開始了高速發(fā)展，Fluidigm不斷改進(jìn)質(zhì)譜系統(tǒng)，相繼推出了Helios（CyTOF3）、CyTOF XT 。2022 年 4 月Fluidigm獲得 Casdin Capital 和Viking Global Investors 的 2.5 億美元投資后，更名為 Standard BioTools（思百拓）。
3.國產(chǎn)質(zhì)譜流式的發(fā)展：
這里要特別說一下質(zhì)譜流式國產(chǎn)化發(fā)展，在這一充滿挑戰(zhàn)的征程中，有幾家國內(nèi)公司那可真是不得不提。上海宸安生物是國內(nèi)第一家吃螃蟹的，2016 年開始成立研發(fā)團(tuán)隊，2021 年上市了首款質(zhì)譜流式儀 ——Starion 星瀚系列，這是全球第二套、國內(nèi)第一套質(zhì)譜流式系統(tǒng)。到 2023 年，宸安生物Starion M1.0 拿到了醫(yī)療器械注冊證，這是全球第一臺被批準(zhǔn)用于體外診斷的質(zhì)譜流式。同年，普羅亭科技的第一款質(zhì)譜流式儀 PLT-MC601 上市并取得了醫(yī)療器械注冊證，在臨床和科研領(lǐng)域同時發(fā)布。還有譜康醫(yī)學(xué)的 MSFLO也發(fā)布上市，這些公司在質(zhì)譜流式這一塊兒都不含糊，不光讓中國智造在國際上更有面子，還把質(zhì)譜流式從設(shè)備到試劑的成本都拉下來了，設(shè)備比有些高端熒光分析流式還便宜，金屬標(biāo)簽抗體價格也變得親民，質(zhì)譜流式不在遙不可及，“舊時王謝堂前燕，飛入尋常百姓家”。
第二站：什么是質(zhì)譜流式，優(yōu)勢，原理及實驗流程
上一站我們一同領(lǐng)略了質(zhì)譜流式的發(fā)展征程。這一站，我們就要引領(lǐng)著各位充滿探索精神的旅行家，揭開質(zhì)譜流式那神秘面紗的一角，深入探尋它究竟是怎樣巧妙地施展 “魔法”，從而實現(xiàn)細(xì)胞多參數(shù)檢測這一神奇而關(guān)鍵的過程，去發(fā)掘隱藏其中的獨特奧秘與精妙機(jī)制。
1.什么是質(zhì)譜流式
質(zhì)譜流式（Mass Cytometry，MC）巧妙融合了流式細(xì)胞術(shù)精準(zhǔn)的單細(xì)胞分析專長以及質(zhì)譜技術(shù)所具備的高靈敏度與卓越的多參數(shù)檢測優(yōu)勢，其使用金屬同位素標(biāo)記的抗體，首先將細(xì)胞樣本進(jìn)行霧化，使之成為能夠被質(zhì)譜儀敏銳捕捉的離子云形態(tài)。隨后，依據(jù)質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio）這一關(guān)鍵指標(biāo)，對這些離子進(jìn)行精細(xì)的分離與精準(zhǔn)的檢測操作，進(jìn)而達(dá)成對細(xì)胞多重參數(shù)的精確定量分析。這種創(chuàng)新性的技術(shù)手段，使得質(zhì)譜流式在單個細(xì)胞水平上能夠一次性同步檢測多達(dá) 40 種以上的各類分子標(biāo)志物
2.質(zhì)譜流式優(yōu)勢
多參數(shù)分析：能夠同時檢測多種生物分子，提供更全面的細(xì)胞信息，有助于深入了解細(xì)胞的功能和狀態(tài)。
高靈敏度：可以檢測到低豐度的生物分子，對于研究稀有細(xì)胞群體和細(xì)胞內(nèi)微量蛋白質(zhì)的變化具有重要優(yōu)勢。
抗串?dāng)_能力強(qiáng)：通過使用金屬標(biāo)簽作為標(biāo)記物，避免了熒光標(biāo)記中常見的光譜重疊和背景信號問題，具有較強(qiáng)的抗串?dāng)_能力。
3.質(zhì)譜流式檢測原理
質(zhì)譜流式巧妙地運用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）與時間飛行質(zhì)譜（TOF-MS）技術(shù)的相得益彰，通過對特異性地與金屬標(biāo)簽緊密結(jié)合的抗體進(jìn)行精準(zhǔn)檢測，以一種高度精確且高效的方式，達(dá)成了在單細(xì)胞的微觀層面上，對多種生物分子展開同步的量化分析，其過程如下：
(1)細(xì)胞霧化
樣品引入：細(xì)胞在被引入質(zhì)譜儀時被霧化成微小的 droplets（液滴）,這個過程將含有金屬標(biāo)簽抗體或其他細(xì)胞探針標(biāo)記的單細(xì)胞懸液引入等離子體炬中（圖2-1）。
(2)細(xì)胞離子化
a.這些液滴隨后進(jìn)入電感耦合氬等離子體（ICP）中，在高溫和高頻電場的作用下，細(xì)胞內(nèi)的共價鍵被斷裂，原子和離子被釋放出來。這個過程是使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）（圖2-2）進(jìn)行，ICP-MS 是一種用于分析元素組成和含量的儀器技術(shù)。在質(zhì)譜流式中，ICP-MS 用于將與金屬標(biāo)簽結(jié)合的細(xì)胞探針中的金屬元素離子化，并根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對其進(jìn)行分離，為后續(xù)TOF-MS提供了元素特異性的檢測信號。
b.等離子體作用：在高頻感應(yīng)耦合等離子體的高溫環(huán)境（約 6000 - 10,000 K）下，樣品中的金屬元素被原子化和離子化，形成金屬離子（圖2-3）。
(3)離子過濾與富集
產(chǎn)生的離子云通過真空錐接口進(jìn)入四極離子偏轉(zhuǎn)器，采用四極桿按照離子的質(zhì)荷比（m/z）對離子進(jìn)行過濾并富集，去除常見的生物元素離子，只富集含有目標(biāo)金屬報告離子（根據(jù)質(zhì)荷比大小）的部分（圖2-4）。這樣可以提高后續(xù)質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確性和特異性，只檢測與抗體結(jié)合的重金屬標(biāo)記的蛋白質(zhì)離子。
(4)時間飛行質(zhì)譜質(zhì)譜檢測
富集后的離子云被送到時間飛行質(zhì)譜儀（TOF-MS）中，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對離子進(jìn)行分離和檢測，不同質(zhì)荷比的離子在飛行時間上有所差異，TOF-MS 用于對經(jīng)過 ICP-MS 離子化后的金屬離子進(jìn)行精確測量，實現(xiàn)了對不同金屬標(biāo)記的生物分子的準(zhǔn)確識別和定量，過程如下（圖2-5）：
離子加速與飛行：離子從離子源中被引出后，進(jìn)入一個高電場區(qū)域，被加速飛向檢測器。離子的飛行速度與其質(zhì)荷比成正比，質(zhì)荷比越大，飛行速度越慢，因此通過測量離子的飛行時間，可以計算出離子的質(zhì)荷比。
飛行時間檢測：離子在飛行過程中，通過飛行時間探測器對其進(jìn)行檢測。探測器記錄離子到達(dá)的時間，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，與相應(yīng)的質(zhì)荷比進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
數(shù)據(jù)采集：TOF-MS 可以在短時間內(nèi)對大量離子進(jìn)行快速測量，從而實現(xiàn)對單細(xì)胞內(nèi)多種金屬標(biāo)記的生物分子的同時檢測和定量分析。
4.質(zhì)譜流式實驗流程
了解了質(zhì)譜流式的檢測原理之后，再讓我們帶各位旅行家看看從細(xì)胞制備到質(zhì)譜流式上機(jī)的完整檢測流程（圖2-7）。
Step1.細(xì)胞采集與準(zhǔn)備：整個分析流程的第一步，獲取單細(xì)胞懸液，以實現(xiàn)單細(xì)胞標(biāo)志物的分析，與傳統(tǒng)熒光流式處理方式及要求一致。
Step2.抗體孵育與細(xì)胞處理（圖2-6）：將單細(xì)胞懸液與帶有金屬標(biāo)簽的抗體進(jìn)行孵育?？贵w與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成抗體 - 蛋白質(zhì)復(fù)合物，以便后續(xù)的檢測。如果要檢測胞內(nèi)的靶標(biāo)，則需要進(jìn)行細(xì)胞破膜（permeabilization）處理。通常使用化學(xué)物質(zhì)或物理方法破壞細(xì)胞膜，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，除了使用的是帶有金屬元素標(biāo)簽的抗體，過程與傳統(tǒng)熒光流式的檢測流程也無差別。
Step3.使用質(zhì)譜流式檢測（詳見3.質(zhì)譜流式檢測原理）。
Step4.數(shù)據(jù)收集與分析：收集到的數(shù)據(jù)被編譯成 FCS 文件，包含了每個細(xì)胞在質(zhì)譜分析中獲得的每種標(biāo)記的金屬離子信號強(qiáng)度。FCS 文件可以使用各種流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計分析和可視化展示，例如繪制細(xì)胞群體的直方圖、散點圖、聚類圖等，幫助研究人員理解細(xì)胞的特征和分布情況，揭示細(xì)胞之間的差異和關(guān)系。
通過這段探索，穿越質(zhì)譜流式的技術(shù)長廊，各位旅行家想必此時已然對質(zhì)譜流式的原理有了更透徹的了解。曾經(jīng)籠罩在質(zhì)譜流式之上的那層神秘面紗，此刻已然被輕輕揭開，以一種親切而明晰的姿態(tài)，展現(xiàn)在各位旅行家的面前。
第三站：目前市場上有哪些質(zhì)譜流式的產(chǎn)品
領(lǐng)略完質(zhì)譜流式的精妙原理之后，各位充滿探索欲的旅行家們，想必此刻心中都懷揣著對當(dāng)下市場中商品化產(chǎn)品的好奇與期待吧？如今市場之中，質(zhì)譜流式產(chǎn)品恰似那春日里生機(jī)勃勃的竹筍，層出不窮且日益豐富多樣，那么，事不宜遲，接下來，就讓我們一起瞅瞅，如今到底有哪些 “寶藏” 產(chǎn)品可供挑選（如有錯誤或者遺漏，歡迎各位旅行家留言或者私信指正），出場順序就按照產(chǎn)品大致上市時間排序。
1.CyTOF XT 質(zhì)譜流式系統(tǒng)（圖3-1）
上市時間：2021 年 5 月 25 日
生產(chǎn)廠商：Standard BioTools（思百拓）（原名Fluidigm）
產(chǎn)品特點：具備135個檢測通道，目前可以實現(xiàn)一管內(nèi)50多個標(biāo)志物進(jìn)行多參數(shù)分析，選配自動化上樣和采集。
2.Starion 星瀚系列質(zhì)譜流式（圖3-2）
上市時間：2021年
生產(chǎn)廠商：上海宸安生物
產(chǎn)品特點：具備140個獨立檢測通道，目前可以實現(xiàn)40色及以上標(biāo)志物檢測，具有臨床醫(yī)療器械注冊證。
3.Lunarion 質(zhì)譜流式細(xì)胞分析儀（圖3-3）
上市時間：2022年12月
生產(chǎn)廠商：上海宸安生物
產(chǎn)品特點：具備140個獨立檢測通道，目前可以實現(xiàn)40色及以上標(biāo)志物檢測，內(nèi)置高通量自動進(jìn)樣器，樣本倉可控溫，有臨床醫(yī)療器械注冊證。
4.MSFLO質(zhì)譜流式細(xì)胞分析儀（圖3-4）
上市時間：2023年
生產(chǎn)廠商：譜康醫(yī)學(xué)
產(chǎn)品特點：采用垂直炬管設(shè)計，垂直引入反射式飛行時間質(zhì)量分析器，具備全通、帶通、單通三種工作模式的多模式四極桿。
5.PLT-MC601質(zhì)譜流式細(xì)胞分析儀（圖3-5）
上市時間：2023年8月生產(chǎn)廠商：普羅亭
產(chǎn)品特點：有130個檢測通道，具備臨床醫(yī)療器械注冊證，可以用于臨床檢測。圖3-5.PLT-MC601 質(zhì)譜流式細(xì)胞分析儀
6.MC-801系列質(zhì)譜流式（圖3-6）
上市時間：2024 年 11月
生產(chǎn)廠商：普羅亭產(chǎn)品特點：具有140個檢測通道，有樣本自動進(jìn)樣器，支持樣本冷卻控溫。
可以看到當(dāng)下質(zhì)譜流式產(chǎn)品的可選種類已然較為豐富多樣了。盡管相較于熒光流式而言，其種類數(shù)量或許尚有差距，但是隨著質(zhì)譜流式技術(shù)的發(fā)展，尤其更多金屬標(biāo)簽的開發(fā)，未來可期。
總結(jié)：
現(xiàn)今，全光譜流式技術(shù)的發(fā)展迅猛，相比較在一定程度上質(zhì)譜流式的發(fā)展確實減緩了，但質(zhì)譜流式恰似一位底蘊深厚的 “高手”，歷經(jīng)漫長歲月打磨自身的技術(shù)，賦予了它出色的檢測穩(wěn)定性，這無疑是其作為老牌強(qiáng)者所擁有的顯著優(yōu)勢，更為關(guān)鍵的是，質(zhì)譜流式的高靈敏度、高分辨率以及高準(zhǔn)確性，可以對單細(xì)胞進(jìn)行深度剖析，這種強(qiáng)大的分析能力在目前的細(xì)胞多色檢測領(lǐng)域中依舊極具競爭力，特別是在國產(chǎn)力量加入這一領(lǐng)域之后，通過不斷研發(fā)創(chuàng)新，使儀器在性能提高的同時，硬件和試劑成本下降，降低了使用門檻，大大增加了用戶的普及范圍，這一切都為質(zhì)譜流式的未來勾勒出充滿希望的畫卷，特別是質(zhì)譜流式衍生出的組織質(zhì)譜成像技術(shù)IMC（Imaging Mass Cytometry），目前在空間蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域有著絕對的優(yōu)勢，今天我們主要還是專注在流式方向，以后有機(jī)會跟各位旅行家聊聊個有趣的技術(shù)。
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